MB6-C 13.4

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MILCH UND MILCHPRODUKTE
Erhitzungsnachweise C 13.4

Bestimmung des Lactulosegehalts von Milch: Referenzmethode
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Zweck und Anwendungsbereich
 
Die Methode ist anwendbar bei Milch. Die Bestimmung der Lactulose dient zur Charakterisierung der Wärmebehandlung von Milch.
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Prinzip
 
In dem von Fett und Eiweiß befreiten, wässerigen Extrakt der Probe werden die Disaccharide Lactose und Lactulose mit Hilfe von ß-D-Galactosidase (ß-Gal) in die jeweiligen Monosaccharide Galactose und Glucose bzw. Galactose und Fructose gespaltenen. Die freigesetzte Fructose ist dem Gehalt an Lactulose äquivalent. Da Lactose in wesentlich größerer Menge in der Milch vorkommt als Lactulose, würde die nach der Spaltung vorhandene Glucose die Fructosebestimmung stören. Deshalb wird die Glucose durch Glucoseoxidase (GOD) in Gegenwart von Sauerstoff weitgehend zu Gluconsäure oxidiert. Dadurch ist es möglich, geringe Mengen Lactulose neben einem Überschuß an Lactose zu bestimmen. Das zunächst zugesetzte und das im Verlauf der Reaktion oben entstehende Wasserstoffperoxid wird durch Katalase zerstört, wobei diese Reaktion gleichzeitig dazu benützt wird, den für die Oxidation der Glucose benötigten Sauerstoff nachzuliefern. Die restliche, nicht oxidierte Glucose und die aus der Spaltung der Lactulose entstandene Fructose werden dann durch Hexokinase (HK) in Gegenwart von ATP (Adenosintriphosphat) phosphoryliert. Das entstandene Glucose-6-phosphat wird durch Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-P-DH) in Gegenwart von NADP+ zum 6-Phosphogluconat oxidiert, wobei NADPH entsteht, dessen Extinktion nach Beendigung der Reaktion bei 340 nm gemessen wird. Danach wird durch Zugabe des Enzyms Phosphoglucose-Isomerase (PGI) Fructose-6-phosphat zu Glucose-6-phosphat isomerisiert und dieses nach Reaktion wie oben beschrieben oxidiert. Durch das erneut entstehende NADPH steigt die Extinktion an, die wieder bei 340 nm gemessen wird. Die Extinktionsdifferenz ist proportional zum Fructose- und damit proportional zum Lactulosegehalt. Um zu vermeiden, daß eventuell vorliegende freie Fructose bei der Bestimmung miterfaßt wird, führt man einen Blindwert mit, dem keine ß-Galactosidase zugefügt wird und dessen Extinktionsdifferenz von der Extinktionsdifferenz der Probe subtrahiert wird; der so korrigierte Wert wird zur Berechnung des Lactulosegehaltes herangezogen.

Methodenbuch VI, 2. Erg. 1993
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